髋关节发育不良患者血清和滑膜炎性因子的作

［作者简介］邬波（１９６２—），男（汉），博士生导师，主任医师，研究方向：创伤骨科、脊柱与关节外科研究．Ｅ?ｍａｉｌ：ｗａｂｃ９６７＠１２６.ｃｏｍ

［摘要］目的：探讨髋关节发育不良（ＤＤＨ）患者血清和滑膜炎性因子的作用机制。方法：选取２０１７年９月至２０１９年９月在我院行人工髋关节置换术的ＤＤＨ患者２５例和股骨颈骨折患者２５例，切取髋关节滑膜行ＨＥ染色，观察２组滑膜的病理改变情况；并利用免疫组化方法检测２组滑膜中的ＩＬ－６、ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１含量；酶联免疫吸附试验分析２组血清样本中ＩＬ－６、ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１含量。结果：ＨＥ染色观察发现ＤＤＨ组滑膜被覆细胞增生，大量炎性细胞浸润，滑膜下层新生血管形成等，对照组未见明显改变；免疫组化染色结果显示，ＤＤＨ组滑膜中的ＩＬ－６及ＭＭＰ－３的表达均较对照组显著增加（Ｐ＜０.０５），酶联免疫吸附试验结果显示，ＤＤＨ组血清中的ＩＬ－６及ＭＭＰ－３均较对照组有显著增加（Ｐ＜０.０５），２组ＴＩＭＰ－１比较差异无统计学意义（Ｐ＞０.０５）。结论：ＩＬ－６和ＭＭＰ－３在ＤＤＨ患者的发病和病情进程中发挥着重要作用。

［关键词］髋关节发育不良；ＩＬ－６；ＭＭＰ－３；ＴＩＭＰ－１

髋关节发育不良（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｄｙｓｐｌａｓｉａｏｆｔｈｅｈｉｐ，ＤＤＨ）是一种常见的发育障碍性疾病，具有长期慢性疼痛和髋关节活动受限等主要病理特征。这种疾病治疗的一般标准是早期发现和早期治疗，９０％的病例可使病情恢复正常［１－２］。晚期ＤＤＨ需要手术治疗严重的发育不良和髋关节脱位［３－５］。然而即使晚期ＤＤＨ手术成功后，文献报道，在４５年随访中仍有４６％的患者需要全髋关节置换术治疗骨性关节炎［４］。因此，ＤＤＨ患者最终将会发展为退变性髋关节炎。本文对ＤＤＨ患者血清和滑膜中炎性因子进行分析研究，阐述ＤＤＨ的病变机制，探讨ＤＤＨ发展为髋关节炎与血清和滑膜中炎性因子的相关性，为ＤＤＨ的保守治疗提供理论指导。

１资料与方法

１.１一般资料以２０１７年９月至２０１９年９月在我院行人工髋关节置换术患者５０例为研究对象，取血清、滑膜标本，其中ＤＤＨ患者２５例为观察组和股骨颈骨折患者２５例为对照组。ＤＤＨ患者包括男８髋，女１７髋，年龄４４～６８岁，平均５５.３岁；股骨颈骨折患者包括男７髋，女１８髋，年龄５０～６９岁，平均５９.３岁。２组患者在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义，具有可比性。纳入标准：（１）Ｃｒｏｗｅ分型Ⅰ－Ⅱ型的髋臼发育不良患者；（２）髋臼疼痛，需行手术治疗者；（３）Ｘ线片髋关节没有严重的退行性改变，日常髋关节没有明显疼痛感觉。排除标准：（１）患有髋关节骨性关节炎的患者；（２）既往经历过髋部手术的患者。本研究经我院伦理委员会批准，患者自愿捐赠标本并签署知情同意书。

１.２主要试剂与仪器ＨＥ染色液（Ｂａｓｏ，珠海贝索）；生物素－链霉卵白素免疫组化检测试剂盒ＳＰ－９００１（ＺＳＧＢ－ＢＩＯ，北京中杉金桥）；抗ＩＬ－６抗体、抗基质金属蛋白酶３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３，ＭＭＰ－３）抗体和抗金属蛋白酶组织抑制因子－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１，ＴＩＭＰ－１）抗体（Ｂｉｏｓｓ，北京博奥森）；Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜及ＣｅｌｌＳｅｎｓｓｔａｎｄａｒｄ图像采集系统。

１.３方法

１.３.１组织学观察关节置换后切取髋关节滑膜，共计５０个标本。将标本置于１０％甲醛溶液中固定，１２％中性ＥＤＴＡ－２Ｎａ常温脱钙１.５ｍｉｎ，经梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后作厚度为４μｍ的连续切片。切片行ＨＥ染色（具体操作详见说明书），观察２组滑膜的病理改变情况。

１.３.２免疫组化分析采用免疫组化ＳＰ法对２组石蜡切片进行ＩＬ－６、ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１免疫组化染色分析。切片脱蜡至水，０.１２５％胰蛋白酶３７℃下行抗原修复２０ｍｉｎ，用体积分数为３％的Ｈ２Ｏ２室温阻断５ｍｉｎ，山羊血清封闭１５ｍｉｎ，在一抗ＩＬ－６（１︰３５０）、ＭＭＰ－３（１︰２００）或ＴＩＭＰ－１（１︰４００）中４℃孵育过夜。冲洗后，分别与生物素标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ反应１ｈ以及链霉卵白素反应１ｈ，最后用含有ＤＡＢ的缓冲液显色，脱水透明，中性树胶封片。免疫组化切片置于１００倍Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜下观察，每个标本随机选取５个不重叠视野，测定５个积分光密度（ｉｎｔｅｇｒａｌｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＩＯＤ）值取平均值，利用Ｉｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓ６.０软件进行图像分析，半定量测定ＩＬ－６、ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１的ＩＯＤ，比较２组ＩＬ－６、ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１的蛋白表达情况。

１.３.３酶联免疫吸附试验抽取患者静脉血２ｍｌ，离心分离血清，将血清标本加入至包被有兔多克隆抗人ＩＬ－６、ＭＭＰ－３或ＴＩＭＰ－１抗体的９６孔微滴定量板中，３７℃孵育ｌｈ。洗涤缓冲液洗３次，加入酶标二抗（经滴定后的稀释度）０.１ｍｌ，３７℃孵育ｌｈ。洗涤３次，加入临时配制的ＴＭＢ底物溶液０.１ｍｌ，３７℃孵育１５ｍｉｎ。２ｍｏｌ／Ｌ硫酸终止反应。酶标仪４５０ｎｍ下检测吸收率。用标准重组人类ＩＬ－６、ＭＭＰ－３或ＴＩＭＰ－１绘制标准曲线。每个血清标本检测３次，取平均值记录实验数据。

１.４统计学方法采用ＳＰＳＳ２２.０软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本ｔ检验。Ｐ＜０.０５为差异有统计学意义。

２结果

２.１组织学观察ＨＥ染色发现，对照组滑膜未见明显增生，被覆细胞排列较为规则，少量炎性细胞浸润，滑膜下层血管组织无明显病理改变。ＤＤＨ组滑膜呈乳头状增生，被覆细胞增生，表面纤维素渗出，大量炎性细胞浸润，滑膜下层新生血管形成，血管扩张，见图１。

２.２免疫组化结果分析ＩＬ－６免疫组化染色于细胞核和细胞之中，ＭＭＰ－３和ＴＩＭＰ－１免疫组化均染色于细胞质中；观察组滑膜中ＩＬ－６及ＭＭＰ－３的棕色物质表达较对照组显著增加，见图２。观察组滑膜中ＩＬ－６、ＭＭＰ－３的ＩＯＤ值显著高于对照组（Ｐ＜０.０５）；２组ＴＩＭＰ－１的表达差异无统计学意义，见表１。

２.３酶联免疫吸附试验结果观察组血清中的ＩＬ－６及ＭＭＰ－３均较对照组显著增加（Ｐ＜０.０５），２组血清ＴＩＭＰ－１比较差异无统计学意义，见表２。

３讨论

ＤＤＨ即髋关节发育异常，通常会导致一系列的有害影响，从中度髋臼发育不良到股骨头半脱位或脱位［６］。中国每年有１％～５％的新生儿受到ＤＤＨ影响，不同人群中女性与男性比例在４︰１～１０︰１之间［７］。其主要解剖学特征包括髋关节变浅，松弛关节囊，关节间隙缩小和髋关节紊乱，导致慢性疼痛，髋关节周围炎症，滑膜增生和髋臼肥大［８］。ＤＤＨ初期以保守治疗为主，通常需口服氨糖类药物及减轻负重，缓解关节疼痛。对于晚期诊断的ＤＤＨ，一般治疗无法使髋关节恢复正常，会导致髋关节的持续退变，表现为关节软骨的退行性病变及髋关节炎，给医疗保健系统带来长期的负担［９］。当ＤＤＨ患者关节磨损严重，疼痛影响日常工作生活时，需行关节置换手术治疗。

ＤＤＨ病变机制复杂，细胞外基质降解是ＤＤＨ重要的病理改变之一［１０］。基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）是细胞外锌依赖性内肽酶的大家族，其在生理和病理条件下催化细胞外基质的产生和降解，ＴＩＭＰｓ作为ＭＭＰｓ的抑制剂起到平衡ＭＭＰｓ的作用［１１－１２］。本研究结果显示，观察组中ＭＭＰ－３的表达较对照组显著增加，高出正常值的１倍，２组中ＴＩＭＰ－１的表达未见明显差异。同时，ＭＭＰ－３在观察组与对照组之间差异较ＴＩＭＰ－１在２组间的差异大，因此推断ＭＭＰ－３的作用超过了ＴＩＭＰ－１的作用，二者间的平衡被破坏而加剧了关节软骨的降解，提示在临床诊断时患者血清中ＭＭＰ－３含量超出正常值１倍时，有发展为骨性关节炎的风险，可提示ＤＤＨ患者在软骨代谢层面上存在严重的关节退变，需药物或减轻负重等保守治疗方法进行干预。本研究结果为研究ＤＤＨ患者关节软骨代谢调节及病程向骨性关节炎发展等方面提供了一种新的视野。ＤＤＨ被认为是骨性关节炎的主要因素之一，但与传统骨性关节炎的病程进展有所不同，本研究结果显示，观察组滑膜呈乳头状增生，被覆细胞增生，表面纤维素渗出，大量炎性细胞浸润，滑膜下层新生血管形成，血管扩张，提示ＤＤＨ患者的滑膜具有滑膜炎症，有进一步发展为骨性关节炎的可能。而ＩＬ－６是Ｔ淋巴细胞分泌的一种炎性促进细胞因子，异常升高促进成纤维细胞和基质小分子的降解，破坏软骨的结构和功能［１３］。本研究中观察组滑膜和血清中的ＩＬ－６的表达较对照组有明显增加，ＤＤＨ组血清中ＩＬ－６的含量高出对照组２倍以上，本研究结果提示ＤＤＨ患者向骨性关节炎发展的过程与ＩＬ－６具有一定的相关性，说明ＩＬ－６在ＤＤＨ的发病发展中起着重要作用，与ＭＭＰ－３及ＴＩＭＰ－１共同作用导致ＤＤＨ的病程进展，为辅助指导临床进行保守治疗干预的提供数据依据。综上所述，ＤＤＨ患者关节软骨内软骨退变指标ＭＭＰ－３、ＴＩＭＰ－１及炎性指标ＩＬ－６可以辅助诊断ＤＤＨ的病程进展，作为ＤＤＨ患者的临床诊断炎性指标。本课题组将对ＤＤＨ的病理改变及发展机制进行进一步研究，为ＤＤＨ患者病程的临床诊断提供理论支持，提示患者加强防护，缩短患者入院诊断时间，缩减诊断流程，以提高保髋手术的疗效。参考文献略